Diversas espécies da família Lauraceae destacam-se por sua importância econômica e fonte de metabólitos secundários com promissoras atividades biológicas, incluindo acaricida. Neste trabalho foi realizado o estudo fitoquímico de extratos de três espécies da família Lauraceae (Ocotea aciphylla, Ocotea spixiana e Sassafras albidum) com diferentes abordagens e avaliação in vitro e in silico da atividade carrapaticida e anticolinesterásica. O extrato acetato de etila do caule de O. spixiana foi analisado por Cromatografia em Camada Delgada de Alta Eficiência (CCDAE) acoplada a Espectrometria de Massas de Ionização de Dessorção por Electrospray (DESI-EM) sendo identificados 17 alcaloides benzilisoquinolínicos e aporfínicos, como boldina, reticulina, glaucina, natenina, entre outros. O extrato mostrou significativa atividade acaricida contra larvas do carrapato Rhipicephalus microplus (LC50:22,04 mg/mL), e o estudo in silico do alcaloide boldina mostrou importantes interações moleculares com a enzima acetilcolinesterase 1 do carrapato. O fracionamento dos extratos acetato de etila e hexânico de O. aciphylla levaram ao isolamento da neolignana oxaguianin e de fitosterol β-sitosterol, identificados por técnicas de ressonância magnética nuclear 1D e 2D. Estes compostos tiveram seu potencial larvicida contra Rhipicephalus microplus e anticolinestásico avaliados, com β-sitosterol se mostrando mais promissor. Os extratos etanólico da raiz, galho e folha de S. albidum foram avaliados por CCDAE-DESI-EM, sendo identificado 13 alcaloides isoquinolínicos. A distribuição espacial destes alcaloides foi realizada através de imageamento por DESI-EM, mostrando diferentes quantidades de alcaloides e padrões de acumulação entre as partes da planta, sendo o maior número e mais ampla distribuição de alcaloides encontrados na raiz. A partir dos resultados, conclui-se que as espécies avaliadas são importantes fontes de metabolitos secundários, principalmente alcaloides, e que O. aciphylla e O. spixiana tem potencial atividade in vitro sobre larvas do carrapato Rhipicephalus microplus.