O gliobalstoma (GBM) é um tumor caracterizado por alto nível de agressividade com sobrevida média de apenas 14,6 meses, proveniente de células-tronco neurais presentes no sistema nervoso central, com grande diversidade histopatológica e genômica. O alto índice de heterogeneidade intratumoral no GBM dificulta o diagnóstico da doença e a adequada intervenção terapêutica. As mitocôndrias são organelas celulares associadas à regulação do metabolismo celular, sinalização redox, geração de energia, regulação da proliferação celular e apoptose. Assim, o acúmulo de mutações no DNA mitocondrial (mtDNA) desempenha um papel importante na patogênese do GBM, favorecendo a produção anormal de energia por meio da glicólise aeróbia e contribuindo para a resistência à apoptose e aos tratamentos convencionais de rádio e quimioterapia. Este cenário torna necessária a introdução de novas linhas de pesquisa que reúnam tecnologias que possibilitem uma melhor análise e compreensão do processo de carcinogênese do GBM, bem como o entendimento da ação do pisosterol, um composto com atividade anti-proliferativa. Dessa forma, o presente trabalho teve como objetivo avaliar a integridade mitocondrial em quatro linhagens celulares de glioblastoma (AHOL1, U343MG, 1321N1 e U-87MG) tratadas e não tratadas com pisosterol em diferentes concentrações (0.5, 1.0 e 1.8 μg/mL-1), baseada na investigação de possíveis alterações nesse genoma. Foram analisados através da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) seis genes do mtDNA (ND1, ND3, COI, COII, COIII, ATPase-6), em seguida foi realizado o sequenciamento automático e posterior análise e comparação das sequências obtidas. O estudo revelou que o tratamento com pisosterol não modificou o padrão de alterações do mtDNA das linhagens de GBM. Identificamos alterações nos genes ND1, ND3 e COI. No gene ND1 foi observada uma transição não sinônima na posição 3547 (AG), que provoca a mudança do aminoácido isoleucina para valina, e uma transversão sinônima na posição 3552 (TA). No gene ND3 também foram identificadas duas transições, a primeira não sinônima localizada na posição 10398 (AG) e a segunda sinônima na posição 10400 (CT). No gene COI uma transição não sinônima foi detectada na posição 7196 (CA). As alterações nos genes do complexo I da cadeia respiratória (ND1 e ND3) foram mais recorrentes do que em outras regiões do mtDNA nas linhagens de GBM analisadas. O Complexo I está relacionado com a manutenção dos níveis de equilíbrio de NAD+/NADH e ROS, com a geração de potencial de membrana mitocondrial e produção de ATP, portanto, sua disfunção é frequentemente a causa de distúrbios e doenças mitocondriais. O tratamento com pisosterol modificou o padrão de alterações do mtDNA das linhagens de GBM de maneira dose dependente. As alterações no mtDNA foram observadas em amostras de GBM não tratadas e tratadas com pisosterol em diferentes concentrações (0.5, 1.0 e 1.8 μg/mL-1). No entanto, as amostras tratadas com 1.0 μg/mL-1 de pisosterol apresentaram a maior quantidade de alterações do mtDNA, dentre elas a amostra U343MG (1.0) apresentou alterações no maior número de genes. O polimorfismo A10398G foi a alteração mais recorrente estando presente em 5 amostras tratadas com pisosterol e 3 amostras não tratadas.