Na natureza, a degradação da biomassa lignocelulósica é realizada principalmente por fungos, microrganismos que produzem um complexo de enzimas celulases que agem sinergicamente para a degradação da celulose. As β-glucosidases atuam na última etapa da degradação desse polímero liberando glicose a partir da hidrólise da celobiose, esse produto, por sua vez, tem grande potencial para ser aplicado na produção de bioetanol. Com o objetivo de produzir extratos enzimáticos com enzimas celulásicas, no atual estudo foi realizada a fermentação submersa dos microrganismos Moniliophthora perniciosa e Candida boidinii que foram obtidos na Coleção de Culturas de Microrganismos da Bahia (CCMB) da Universidade Estadual de Feira de Santana, Brasil. A determinação da atividade da β-glucosidase nos diferentes extratos mostrou maior influência do pH ácido e pH próximo a neutralidade para as enzimas produzidas por M. perniciosa e C. boidinii, respectivamente, ambas as enzimas apresentaram maior atividade em temperaturas elevadas e mostraram ser termicamente estáveis. Os extratos enzimáticos foram eficazes na hidrólise do bagaço de cana de açúcar pré-tratado apresentando alto percentual de açúcares redutores. A imobilização por adsorção nos suportes celite e quitosana mostrou ser uma alternativa para a reutilização da enzima. O método de imobilização por aprisionamento no alginato de cálcio permitiu que a enzima fosse utilizada na hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar em ciclos consecutivos. Esses resultados revelam eficácia tanto da enzima na forma livre, quanto imobilizada, com perspectivas para aplicação na hidrólise de matérias lignocelulósicos e outros segmentos industriais.