A tendência dos próximos anos é o uso de produtos agrícolas biológicos (bioinsumos) e multifuncionais. Essa pesquisa buscou empregar diferentes técnicas microbiológicas para esclarecer o estabelecimento e a eficiência de inoculantes mistos (co-cultivo), comparando-o aos inoculantes individuais de bactérias diazotróficas selecionadas para aplicação em cana-de-açúcar. Objetivou-se avaliar a eficiência de um inoculante contendo Gluconacetobacter diazotrophicus (BR11281) e Paraburkholderia tropica (BR11366) co-cultivadas no desenvolvimento inicial e na arquitetura radicular de milho híbrido SHS5050, utilizado como planta modelo devido sua homogeneidade e maior facilidade de cultivo. O trabalho analisou a produção de fitohormônios no co-cultivo comparado ao crescimento individual das duas estirpes e a aplicação exógena de diferentes concentrações de reguladores de crescimento como o AIA, GA3 e a Zeatina. Além disso, foi quantificada a produção de fitohormônios pelas estirpes estudadas através da técnica de monitoramento de íons selecionados por GC-MS, e o estabelecimento das bactérias inoculadas no interior das raízes usando a técnica de FISH e qPCR. Para a avaliação dos ganhos de massa e dos parâmetros radiculares do milho inoculado foram conduzidos cinco experimentos em casa de vegetação. As duas estirpes cresceram concomitantemente, sendo possível produzir o inoculante a partir deste co-cultivo. Os bioensaios mostraram que 40 nM de AIA e 20 µM de GA3 e Zeatina estimulam o crescimento radicular do milho com incrementos de 69 e 84% para comprimento, 47 e 50% para área projetada e área de superfície em 28 e 22% para volume, respectivamente. Além disso as respostas de crescimento radicular do co-cultivo e do sobrenadante foram semelhantes as respostas da melhor concentração dos fitohormônios testados. Esses resultados foram corroborados com a quantificação dos fitohormônios que mostrou que o co-cultivo tem maior concentração de AIA (19,6 ng/mL), GA3 (20,5 nM/mL) e Zeatina (10,7 nM/mL) que os cultivos individuais e a extração do sobrenadante intensificou essas concentrações: AIA (29,8 ng/mL), GA3 (29,1 nM/mL) e Zeatina (14,3 nM/mL). A técnica FISH permitiu a visualização das estirpes no interior das raízes, comprovando que as bactérias inoculadas se estabelecem no interior da planta e que ambas coabitam os mesmos nichos; preferindo as regiões do apoplasto, superfície radicular, ponta e pelos radiculares. Concluiu-se que o milho inoculado com as duas bactérias co-cultivadas diferiu do tratamento com elas aplicadas separadamente, sendo estes superiores ao controle principalmente no desenvolvimento radicular.