As rochas carbonáticas da Formação Itaituba datam aproximadamente 300 milhões de anos atrás, preservando eventos geológicos e processos biogeoquímicos de degradação de matéria orgânica, sugestiva para a presença de actinobactérias com propriedades ainda não documentadas. Portanto o presente estudo propõe-se a realizar a bioprospecção de actinobactérias isoladas de rochas carbonáticas na Amazônia. Foram avaliados 21 isolados, PML1 à PML21, na produção de substâncias antimicrobianas pela técnica de difusão em ágar contra patógenos para identificar os isolados promissores. A caracterização morfológica e bioquímica ocorreu seguindo o International Streptomyces Project. A partir da obtenção dos extratos através do solvente acetato de etila, foi avaliada a ação citotóxica linhagem de células de câncer colorretal humano (HCT-116) atividade e antioxidante dos isolados mais promissores. Em seguida, foi realizado os testes CLAE-DAD e CG-EM. Morfologicamente, a maioria dos isolados apresentou micélio aéreo branco e vegetativo amarelo. Das 21 actinobactérias isoladas, 13 foram ativas contra ao menos um dos 11 patógenos testados, com espectro de ação variando entre bactérias Gram positivas e Gram negativas. Houve destaque para PML5 com halo de 16 mm + 0,00 contra Salmonella enteridis INCQS00268, PML11 com halo de 27 mm + 0,00 contra Micrococcus lutteus ATCC7468 e PML15 com halo de 17 mm + 1,0 contra Proteus vulgaris ATCC13315 e 17 mm + 0,00 contra Aeromonas hydrophyla INQS00318. Com relação à produção enzimática, os isolados promissores apresentaram índice enzimático para Lipase, Esterase, Caseinase e positividade para Catalase. O teste citotóxico evidenciou a atividade citotóxica de PML5 com uma inibição de 96,5% do crescimento celular da linhagem de células de câncer colorretal humano (HCT-116), sendo, portanto, o isolado mais promissor. Foi constatado, também a ação antioxidante da PML5 pela captura do radical livre ABTS com uma inibição de 35,60%, e pela captura do radical livre DPPH com ação de 10,65%, na concentração testada. O extrato da linhagem PML5 foi analisado por CLAE mostrou a presença de quatro picos, onde houve padrões de absorbância semelhantes indicando a possibilidade do extrato possuir rotas metabólicas sintetizadoras de substâncias da mesma classe. O CG-EM do extrato mostrou a presença de 10 compostos voláteis. O principal composto foi o Ciclododecano em comparação com outros compostos bioativos. Esses resultados demonstram o potencial da biodiversidade amazônica, revelando o isolado de rocha carbonática PML5 como produtora de substâncias antimicrobianas, citotóxicas e antioxidante de interesse para a indústria biotecnológica.