Fatores como carga excessiva de trabalho e sedentarismo podem provocar ou acentuar sintomas de depressão e ansiedade em profissionais que atuam em hospitais universitários. O objetivo primário desse estudo é verificar a prevalência desses sintomas nos profissionais. O objetivo secundário é investigar a associação entre o nível de atividade física e a prevalência desses sintomas de acordo com a área de atuação profissional. Portanto, neste estudo transversal, 199 participantes responderam um questionário para avaliação dos sintomas de depressão, ansiedade e nível de atividade física. Os resultados foram analisados em relação ao total de participantes e conforme as três áreas de atuação profissional (médica, assistencial e administrativa). Para as comparações de acordo com a área de atuação foram utilizados os testes Qui-quadrado e Kruskal-Wallis. Para verificar os efeitos do nível de atividade física em relação aos sintomas foram utilizadas análises de regressão simples e multivariada. O nível de significância de 5% foi adotado. A prevalência dos sintomas de depressão e ansiedade no total de participantes foram 44,2% e 54,2%, respectivamente. Os níveis de atividade física considerados ativos e muito ativos foram associados a menores escores de sintomas de depressão ( = -0,41, p = 0,001) e ansiedade ( = -0,09, p = 0,017), respectivamente, em relação aos indivíduos sedentários. Em conclusão, o presente estudo identificou alta prevalência de sintomas de depressão e ansiedade entre os profissionais. Ainda, os profissionais da área médica e assistencial ativos fisicamente apresentaram menores sintomas de depressão e ansiedade.