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Dados do Trabalhos de Conclusão

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE FEIRA DE SANTANA
BIOTECNOLOGIA (28002016006P3)
Avaliação da genotoxicidade e da citotoxicidade de produtos utilizados na terapia pulpar de dentes decíduos com o uso do teste de micronúcleo em medula óssea de camundongos e do ensaio cometa em linfócitos humanos
NILTON CESAR NOGUEIRA DOS SANTOS
TESE
29/06/2015

A terapia pulpar de dentes decíduos se constitui no último recurso de prevenção da perda dentária, mas, dentre os produtos empregados para tal, as denominadas pastas obturadoras, nenhum é considerado como ideal. Adicionalmente, não há consenso sobre os efeitos genotóxicos e/ou citotóxicos destas pastas e, para algumas delas, é escasso o registro na literatura de tais efeitos. O objetivo deste trabalho foi avaliar, com o uso do teste de micronúcleo em medula óssea de camundongo e do Ensaio cometa em linfócitos humanos, os efeitos citotóxicos e genotóxicos de quatro pastas obturadoras utilizadas nesta terapia: óxido de zinco, hidróxido de cálcio P.A., agregado trióxido mineral e uma pasta iodoformada (Pasta Guedes-Pinto). Para realização do teste de micronúcleo, camundongos Swiss (Mus musculus), machos, foram divididos em grupos de dez animais: Quatro grupos foram expostos, cada um, a uma das pastas obturadoras, administradas via intraperitoneal (0,1ml/10g de peso corpóreo) nas diluições de 1/10, 1/50, 1/500 e 1/1000. Ciclofosfamida (50mg/kg) foi utilizada como controle positivo. Os controles negativos utilizados foram os veículos de diluição: dimetilsulfóxido (DMSO) para a Pasta Guedes e óxido de zinco e solução salina tamponada (PBS) para o hidróxico de cálcio P.A. e agregado trioxido mineral. Os animais foram sacrificados, 24h e 48h após tratamento (cinco animais em cada um destes tempos). A medula óssea foi extraída e o material processado de acordo com o protocolo de Schmid (1976) para cômputo da ocorrência de micronúcleos em 1000 eritrócitos policromáticos (PCE) de cada um dos animais, sob microscopia óptica (1000X) e em teste cego. A citotoxicidade foi avaliada pela determinação da relação PCE (eritrócito policromático) / NCE (eritrócito normocromático) em 200 eritrócitos/animal. O Ensaio cometa foi feito de acordo com o Protocolo de Singh et al. (1988). Linfócitos humanos obtidos de sangue periférico de doador saudável (3ml) foram cultivados em diferentes diluições de cada uma das pastas obturadoras (1:500, 1:750, 1:1000 e 1:2000), durante 3h, a 37°C, em atmosfera de 5% de CO2. Foram utilizados dois controles positivos: metil-metanosulfonato (0,4µM) para o hidróxido de cálcio P.A. e agregado trióxido mineral, e doxorrubicina (0,6 µM) para a Pasta Guedes e óxido de zinco. Foram também dois os controles negativos utilizados: água destilada para o hidróxido de cálcio P.A. e agregado trióxido mineral, e DMSO para Pasta Guedes e óxido de zinco. A identificação do cometa (análise qualitativa) foi realizada sob microscopia de fluorescência (400X), sendo computados 100 deles em cada uma das três lâminas analisadas para cada droga teste. Um índice de danos foi estabelecido considerando o padrão de escores previamente determinados pelo tamanho e intensidade da cauda do cometa. A análise estatística dos resultados do teste de micronúcleo foi realizada com o uso do Teste Condicional para Comparação de Proporções em Situação de Eventos Raros, que é um teste de significância alternativo ao qui-quadrado. Análise de Variância, seguida do Teste de Tukey, foram utilizados para avaliação da relação PCE/NCE obtida com os diferentes tratamentos e também para comparação das médias dos índices de danos ao DNA obtidos no Ensaio cometa com o software Prisma versão 4.0. A ocorrência de micronúcleos foi significativamente maior nos animais tratados com a Pasta Guedes em todas as diluições testadas, nos dois tempos de sacrifício. Ocorrência maior de micronúcleos foi observada entre os animais tratados com óxido de zinco e sacrificados 48h após tratamento, nas diluições 1:50; 1:500 e 1:1000. Efeitos citotóxicos destas pastas foram detectados nos animais sacrificados nos dois tempos. O hidróxido de cálcio P.A. e o agregado trióxido mineral não apresentaram efeitos citotóxicos nem genotóxicos. Os resultados obtidos com o Ensaio cometa também apontaram para a genotoxicidade do óxido de zinco e Pasta Guedes, e não do hidróxido de cálcio P.A. e agregado trióxido mineral. Estes resultados mostram a necessidade de reavaliação do uso do óxido de zinco e Pasta Guedes e suscitam a realização de estudos adicionais avaliando a genotoxicidade e citotoxicidade destas pastas.

Pastas obturadoras, Teste de Micronúcleo, Ensaio Cometa, Gentoxocidade, Citotoxicidade
Pulp therapy for deciduous teeth is the last resort for preventing tooth loss, but among the products used for this, i.e. so-called filling pastes, none is considered to be ideal. In addition, there is no consensus regarding the genotoxic and/or cytotoxic effects of these pastes and, for some of these pastes, there is little record of such effects in the literature. The objective of this study, using the micronucleus test on the bone marrow of mice and the comet assay on human lymphocytes, was to evaluate the genotoxic and cytotoxic effects of four filling pastes that are used in this therapy: zinc oxide, calcium hydroxide P.A., mineral trioxide aggregate and an iodoform paste (Guedes-Pinto paste). To perform the micronucleus test, male Swiss mice (Mus musculus) were divided into groups of ten animals each: four groups were each exposed to one of the filling pastes, administered intraperitoneally (0.1 ml/10 g of body weight) at dilutions of 1/10, 1/50, 1/500 and 1/1000. Cyclophosphamide (50 mg/kg) was used as the positive control. The negative controls used were the dilution vehicles: dimethylsulfoxide (DMSO) for the Guedes paste and zinc oxide; and phosphate-buffered saline solution (PBS) for the calcium hydroxide P.A. and mineral trioxide aggregate. The animals were sacrificed 24 h and 48 h after the treatment (five animals at each of these times). The bone marrow was extracted and the material was processed in accordance with the protocol of Schmid (1976), in order to calculate the micronucleus occurrence rate in 1000 polychromatic erythrocytes (PCE) in each of the animals, under an optical microscope (1000 X), in a blinded test. Cytotoxicity was evaluated by determining the PCE/NCE (normochromatic erythrocyte) ratio in 200 erythrocytes/animal. The comet assay was performed in accordance with the protocol of Singh et al. (1988). Human lymphocytes obtained from the peripheral blood of a healthy donor (3 ml) were cultured in different dilutions of each of the filling pastes (1:500, 1:750, 1:1000 and 1:2000), for 3 h at 37 °C, under an atmosphere containing 5% CO2. Two positive controls were used: methyl-methanesulfonate (0.4 µM) for the calcium hydroxide P.A. and mineral trioxide aggregate; and doxorubicin (0.6 µM) for the Guedes paste and zinc oxide. Two negative controls were also used here: distilled water for the calcium hydroxide P.A. and mineral trioxide aggregate; and DMSO for the Guedes paste and zinc oxide. Comets were identified (qualitative analysis) by means of fluorescence microscopy (400 X), and 100 of them were counted on each of the three slides that were analyzed for each drug test. A damage index was established, taking into consideration the score pattern that had previously been determined from the size and intensity of the comet tail. The statistical analysis on the results from the micronucleus test was performed using the conditional test for comparing proportions in situations of rare events, which is a significance test providing an alternative to the chi-square test. Analysis of variance, followed by the Tukey test, was used to assess the PCE/NCE ratio obtained from the different treatments and also to compare the means from the DNA damage indices that were obtained through the comet test, using the Prisma software, version 4.0. The micronucleus occurrence rate was significantly higher among the animals treated with Guedes paste, at all the dilutions tested and at both sacrifice times. Greater occurrence of micronuclei was observed among the animals treated with zinc oxide and sacrificed 48 h after treatment at the dilutions of 1:50, 1:500 and 1:1000. Cytotoxic effects from these pastes were detected in the animals sacrificed at both times. Calcium hydroxide P.A. and mineral trioxide aggregate did not present any cytotoxic or genotoxic effects. The results obtained from the comet assay also showed that zinc oxide and Guedes paste presented genotoxicity, whereas calcium hydroxide P.A. and mineral trioxide aggregate did not. These results show that there is a need to reassess the use of zinc oxide and Guedes paste and provide encouragement for conducting additional studies to evaluate the genotoxicity and cytotoxicity of these pastes.
Filling pastes, Micronucleus test, Comet assay, Genotoxicity, Cytotoxicity
01
94
PORTUGUES
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE FEIRA DE SANTANA
O trabalho possui divulgação autorizada
nilton_cesar_nogueira_santos_tese.pdf

Contexto

BIOTECNOLOGIA COM ÊNFASE EM RECURSOS NATURAIS DA REGIÃO NE
ATIVIDADES BIOLÓGICAS DE PRODUTOS NATURAIS, RECOMBINANTES E SINTÉTICOS
Atividades biológicas de produtos naturais da biota da região Nordeste

Banca Examinadora

ENEIDA DE MORAES MARCILIO CERQUEIRA
DOCENTE - PERMANENTE
Sim
Nome Categoria
VALERIA SOUZA FREITAS Participante Externo
GABRIELA BOTELHO MARTINS Participante Externo
JOSE ROBERTO CARDOSO MEIRELES Participante Externo
NORA NEY ALVES SANTOS Participante Externo

Vínculo

Servidor Público
Instituição de Ensino e Pesquisa
Ensino e Pesquisa
Sim
Plataforma Sucupira
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