Enzimas chave do metabolismo de Moniliophthora perniciosa, agente causador da Vassoura-de-bruxa na cultura cacaueira, têm sido alvo de estudos na busca de novos fungicidas. A análise in sílico da sua Esqualeno Epoxidase (EE) (enzima da rota de biossíntese do Ergosterol), permitiu a descrição de inibidores enzimáticos. A produção recombinante desta enzima é fundamental para testar in vitro estes inibidores. Este trabalho visa a clonagem recombinante desta EE, além de otimizar e padronizar a sua expressão a partir da comparação entre duas cepas de E. coli [BL21(DE3) e Rosetta(DE3)] e dois vetores de expressão (pET28a e pF3a). O gene ERG1 foi otimizado, sintetizado e inserido nos vetores de expressão. Após a transformação da cepa de clonagem Topo10, os plasmídeos recombinantes foram extraídos e inseridos nas cepas de Expressão. Foram testadas duas cepas de expressão sob 3 temperaturas e concentrações de IPTG. A análise da expressão foi feita em SDS-PAGE. A análise da sequência otimizada do gene ERG1 apresentou a mesma sequência codificante de origem, que possui alta similaridade com a sequência de M. roreri. O inserto foi clonado com sucesso no vetor pF3a. A melhor condição de indução da expressão de EE inclui: incubação a 30 °C, com 0,25 mM de IPTG, por 20 horas, utilizando a cepa Rosetta (DE3). Esse é o primeiro relato de produção de uma EE de fungo a partir de células de E. coli, que poderá ser utilizada como ferramenta na seleção in vitro de inibidores. Além disso, as condições ótimas desse trabalho podem ser aplicadas como estudo para M. roreri, outro fitopatógeno da cultura cacaueira.