Os fungos são um dos grupos de organismos mais diversos da Terra. Atualmente, são conhecidas aproximadamente 105 mil espécies de fungos, correspondendo a apenas cerca de 7% do total estimado em 1,5 milhões de espécies. A identificação dos fungos é baseada quase que exclusivamente em sua morfologia tanto macro como microscópica. Como eles habitam os mais variados substratos, apresentam em decorrência, uma sucessão formidável de tipos morfológicos, dos mais simples aos mais complexos. O código de barras de DNA é um sistema de identificação molecular que vem sendo recentemente utilizado com a finalidade de identificar espécies conhecidas (já descritas) e facilitar a identificação de espécies novas (ainda não-descritas). Diante desse contexto, o presente trabalho teve como objetivo estabelecer uma biblioteca de códigos de barra de DNA de fungos depositados na Coleção de Cultura de Micro-organismos da UEFS (CCMB). Foi, portanto, extraído o DNA genômico dos isolados selecionados, amplificada a região de código de barras de DNA de fungos (ITS) por PCR qualitativo simplex dos isolados selecionados e, por fim, sequenciado os produtos de PCR amplificados por sequenciamento tradicional. As sequências geradas foram editadas e comparadas com as bases dos dados moleculares e com a identificação morfológica prévia. O resultado foram os códigos de barras de DNA gerados dos acessos (isolados) depositados na CCMB e a análise de barcode gap tradicional dessas amostras comparando com sequências do GenBank. No estudo, 30 amostras foram isoladas e sequenciadas, resultando em 10 gêneros diferentes que foram feitas análises de barcode gap para avaliar as distâncias intra e interespecíficas. A partir das análises dos gráficos de caixa e de pontos, cada gênero foi então classificado em três categorias distintas: (1) bom, (2) regular e (3) ruim, dependendo da sobreposição das distâncias intra e interespecíficas das amostras, analisadas par-a-par. Os gêneros: Phellinus, Ganoderma e Trametes obtiveram performance regular (categoria 2); Phellinus e Shizophyllum obtiveram performance ruim (categoria 3), uma vez que, houve uma total sobreposição das distâncias genéticas intra e interespecíficas. Os gêneros Fomes, Lentinus, Laetiporus, Polyporus obtiveram nítido barcode gap e foram classificados em categoria 1 (boa performance) de 0,7%; 1,2%; 0,7% e 0,7%, respectivamente. No gênero Abortiporus não foi possível fazer análise de barcode gap, já que só há depósito de uma espécie do fungo.