Uma grande preocupação das indústrias produtoras de queijo de longa maturação é a contaminação por fungos, devido o mesmo gerar desclassificação do produto, retrabalho, perdas econômicas, bem como sabores atípicos no produto final. Desta forma, este trabalho tem a finalidade de identificar em qual etapa a contaminação ocorre, para que medidas corretivas sejam adotadas para sua redução evitando problemas no produto final. Testes preliminares na linha de produção do queijo Parmesão foram realizados e a partir dos resultados foram selecionadas etapas do processo produtivo para investigação da contaminação por fungos. Foram analisados swabs de equipamentos e manipuladores, o ar ambiente e o queijo, utilizando o meio de cultura ágar DRBC incubados a 25°C por 5 dias. Os fungos encontrados e que manifestaram características visuais das colônias, como cor, rugosidade, exsudação foram repicados e isolados. Para visualização em microscópio óptico e identificação morfológica a metodologia usada foi o microcultivo em placas, a qual permitiu verificar que se tratava de Penicillium spp., constituindo de conidióforos, métulas, fiálides e conídios. As amostras de queijos coletadas durante a maturação foram encaminhadas para análise da aflatoxina M1 (AFM1) através da cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). Os resultados encontrados mostraram que o queijo se contamina de maneira significativa nas câmaras de maturação, onde o queijo permanece por pelo menos 6 meses. Os queijos que apresentaram maiores contaminações por fungos foram acomodados na câmara 6 de maturação, denominada P6 onde a contaminação do ar ambiente e prateleiras foram significativas. O resultado para a análise de AFM1 nos queijos apresentaram-se negativos para todas as amostras analisadas.