A geoprópolis é um tipo de própolis produzida por algumas espécies de abelhas sem ferrão, que consiste na mistura de resina, cera e solo. As propriedades farmacológicas desse produto são conhecidas desde os tempos remotos, porém, ao contrário do que ocorre com a própolis produzida por abelhas da espécie Apis mellifera, os estudos disponíveis na literatura são escassos. As abelhas nativas sem ferrão são as principais responsáveis pelo processo de polinização e representam uma importante fonte de renda para os meliponicultores. Com o objetivo de determinar o perfil químico e algumas das atividades biológicas de amostras de geoprópolis produzidas pela espécie de abelha sem ferrão Melipona quadrifasciata anthidioides Lepeletier, foram obtidos extratos etanólicos de geoprópolis coletadas em meliponários localizados em pontos distintos da cidade de Alfenas-MG. Os extratos etanólicos identificados como Q1, Q2 e Q3 foram avaliados quanto ao perfil de absorção da luz ultravioleta e determinação do conteúdo fenólico total. A caracterização química foi realizada por cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a espectrômetro de massas em tandem (HPLC-MS/MS). As amostras foram submetidas a ensaios in vitro para a determinação das atividades antimicrobiana, sinérgica, antiproliferativa e antioxidante. Os extratos apresentaram perfis químicos semelhantes, com picos de absorção no ultravioleta característicos de compostos fenólicos. Um alto conteúdo fenólico foi determinado no ensaio de quantificação, e a presença de ácidos fenólicos e flavonoides pôde ser confirmada pela identificação desses compostos por HPLC-MS/MS. As amostras foram promissoras quanto à atividade antimicrobiana, apresentando concentração inibitória mínima (CIM) 7,80-15,625 µg/mL (Q1), 31,25-62,50 µg/mL (Q2) e 15,625-31,25 µg/mL (Q3) contra o Bacillus cereus, CIM 125-250 µg/mL (Q1 e Q2) e 62,50-125 µg/mL (Q3) contra Staphylococcus epidermidis e Staphylococcus aureus. As amostras Q2 e Q3 exibiram CIM inferior à do sulfametoxazol + trimetoprima (antibiótico utilizado como padrão) contra as cepas de Staphylococcus aureus multirresistentes a antibióticos (CIM amostras: 125-250 µg/mL; CIM antibiótico: >400 µg/mL) e de Enterococcus faecalis (CIM amostra Q3: 125-250 µg/mL; CIM antibiótico: >400). Efeito parcialmente sinérgico foi observado na associação dos extratos Q1, Q2 e Q3 com o antibiótico sulfametoxazol + trimetoprima com Índice de combinação inibitória fracionária (ICIF) de 0,5198 (Q1 e Q2) e 0,5276 (Q3). Os extratos Q2 e Q3 foram inativos contra todas as linhagens tumorais e não tumoral humanas testadas, ao passo que Q1 exibiu fraca atividade antiproliferativa contra a linhagem de câncer de próstata, ovário, cólon e leucemia, não apresentando atividade contra a linhagem não tumoral nas concentrações testadas. A atividade antioxidante apresentada pelas amostras foi relevante, superior à de amostras de própolis de outras regiões do Brasil e do mundo, com Q3 apresentando os melhores resultados. Os flavonoides e ácidos fenólicos identificados neste trabalho são conhecidos pelas propriedades antimicrobiana e antioxidante que possuem e são frequentemente relacionados às atividades biológicas das geoprópolis. Portanto, os dados obtidos neste estudo confirmam e evidenciam o potencial bioativo da geoprópolis de Melipona quadrifasciata anthidioides Lepeletier, além de permitir a correlação desse potencial com os compostos presentes nos extratos.