A acetilcolinesterase (AChE) é uma enzima essencial para a sobrevivência do carrapato e representa um importante alvo para o desenvolvimento de acaricidas. Como a estrutura 3D da AChE do Rhipicephalus microplus ainda não está disponível, o presente trabalho teve como objetivo construir esta estrutura 3D por modelagem de homologia. O modelo foi validado usando programas computacionais (gráfico Ramachandran por PROCHECK, Verfiy3D, ANOLEA e Z-Score por QMEAN6) e foi otimizado por uma simulação de dinâmica molecular. O modelo desenvolvido foi utilizado para avaliar a atividade anticolinesterásica de flavonoides (quercetina, rutina, diosmina, naringina e hesperidina) e de um acaricida sintético (diazinon) por acoplamento molecular. Além disso, foram realizados ensaios in vitro (ensaios de inibição da AChE de larvas e de atividade larvicida de R. microplus). O modelo de AChE foi construído e mostrou-se aceitável nas avaliações estérica e energética. Nas simulações de dinâmica molecular, a estrutura 3D da AChE permaneceu estável a partir dos 17ns, com o valor de RMSD de 3,6 ± 0,4 Å. O acoplamento molecular mostrou que apenas o diazinon e a quercetina apresentaram afinidade de ligação ao AChE, com uma pontuação negativa no gridscore: -45,35 e -39,44 kcal/mol, respectivamente. Dentre os flavonoides, a quercetina promoveu maior inibição in vitro da atividade da AChE (15,8%) e mortalidade de larvas (30,2%). O diazinon exibiu elevado efeito anticolinesterásico in vitro (100%). Os resultados in vitro corroboraram com estudos in silico, indicando que a estrutura 3D de AChE de R. microplus representa um bom modelo e pode ser utilizada para a identificação de novas substâncias com potencial efeito carrapaticida.