O queijo Parmesão é um dos queijos mais apreciados e consumidos no mundo inteiro. Frequentemente, a produção do Parmesão envolve a utilização de soro-fermento, um cultivo natural em que se consegue a propagação no soro de bactérias láticas naturais selecionadas. O presente estudo teve por objetivo quantificar, isolar, caracterizar e identificar as bactérias láticas presentes no soro-fermento de uma indústria de laticínios produtora de queijo Parmesão no estado de Minas Gerais (Brasil). No início (tempo 0) e durante o processo de fermentação (7, 14 e 16 h), as populações de bactérias láticas em ágar MRS e ágar M17, a acidez e o pH do soro-fermento foram analisados. Verificou-se que as populações de bactérias estiveram em contagens entre 5,9 x 102 e 4,5 x 104 UFC/mL. Apesar da baixa viabilidade de bactérias láticas, a acidez do soro durante a fermentação aumentou exponencialmente até 14 horas, atingindo valor de 119,3 ºD. Das populações de bactérias láticas, 80 isolados foram caracterizados em relação à parede celular (coloração de Gram), catalase, morfologia das células, crescimento em diferentes temperaturas (10, 30, 40 e 45 ºC) e em diferentes concentrações de NaCl (4 e 6,5%) e em relação à capacidade de fermentação de glicose, maltose, manitol e lactose. Após a caracterização, foi possível identificar 16 isolados de espécies pertencentes aos gêneros Lactococcus, Streptococcus, Lactobacillus e Enterococcus. Além da caracterização bioquímica, amostras de soro-fermento também foram analisadas genotipicamente, sendo possível identificar, entre outras, as espécies Paenibacillus illinoisensis, Lactococcus lactis, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus helveticus e Lactobacillus delbrueckii. Concluiu-se que o soro-fermento utilizado na fabricação de queijo Parmesão possui uma baixa contagem de bactérias láticas, não demonstrando, entretanto, a partir da observação cotidiana da empresa, um impacto negativo para a produção de queijo Parmesão. À empresa colaboradora do estudo, foi sugerido o monitoramento das características microbiológicas do soro-fermento em pelo menos 3 vezes ao ano, tanto em relação às contagens das populações como a identificação genotípica de espécies dos micro-organismos presentes.