O uso de óleos essenciais como alternativa natural aos aditivos químicos para controle do crescimento microbiológico e consequente manutenção da segurança alimentar tem ganhado destaque nos últimos anos. O alho negro é produzido a partir do alho in natura através da aplicação de tratamento térmico em temperatura e umidade controladas, por um determinado período de tempo. As condições de processamento são responsáveis por um conjunto de alterações no material vegetal que culminam na alteração de suas propriedades físico-químicas e microbiológicas O desenvolvimento da coloração negra no alho in natura durante seu processamento se deve à reação de Maillard e consequente formação de melanoidinas. Apesar da existência de estudos caracterizando algumas de suas propriedades, bem como investigando as melhores condições de processamento, não há relatos acerca da identificação dos constituintes químicos presentes no óleo essencial de alho negro, bem como de suas propriedades antimicrobianas. O objetivo do presente trabalho foi caracterizar quimicamente os óleos essenciais de alho negro e alho in natura e proceder à avaliação de suas propriedades antimicrobianas. Foram realizadas análises físico-químicas de umidade, cinzas, atividade de água, acidez, pH, cor e proteína dos bulbos de alho negro e alho in natura. Em seguida, os óleos essenciais de dois lotes de alho negro (AN1 e AN2) e de alho in natura (AB1 e AB2) foram extraídos para identificação de seus constituintes químicos e determinação de suas concentrações inibitórias e bactericidas frente à Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Staphylococcus epidermidis e Pseudomonas aeruginosa. Constatou-se diferença significativa para todos os parâmetros físico-químicos avaliados, revelando que os bulbos de alho negro apresentam menor pH (4,65), maior acidez (23,74%) e concentração de nutrientes, devido à desidratação parcial. Quanto à caracterização química dos óleos essenciais, verificou-se a presença apenas de metabólitos contendo enxofre em ambos. No caso do óleo essencial de alho in natura, os dois compostos majoritários foram dialil-dissulfeto e dialil-trissulfeto para os dois lotes avaliados (AB1 e AB2), compreendendo pelo menos 70% da composição dos referidos lotes, o que está de acordo com relatos da literatura. Para os óleos essenciais de alho negro (lotes AN1 e AN2), 4-metil-1,2,3-tritiolano (30,03% e 53,06%) e 5-metil-1,2,3,4-tetratiano (21,8% e 27,24%) foram os componentes principais. Um número maior de compostos foi identificado para os lotes de alho negro, devido ao aquecimento envolvido na sua produção, que resultou em reações de degradação térmica. Quanto à atividade antimicrobiana, o óleo essencial de alho negro apresentou um maior potencial inibitório e bactericida contra todas as bactérias avaliadas quando comparado ao alho in natura. A maior atividade antimicrobiana foi verificada frente a P. aeruginosa, sendo verificado concentração inibitória e bactericida mínima de 125 μg mL-1 para o lote AN1, e 500 μg mL-1 para o lote AN2. O alho negro avaliado neste trabalho mostrou-se mais promissor para controle microbiológico, entretanto, como a composição química do óleo essencial não é única, variando com diversos fatores, ressalta-se a necessidade de condução de novos estudos para isolamento e identificação dos compostos responsáveis pela atividade antibacteriana.