FROES, T.Q. Inibidores da via de biossíntese de piocianina em Pseudomonas aeruginosa: uma nova alternativa para o desenvolvimento de fármacos anti-virulência. 2019. 157p. Tese [Doutorado em Biotecnologia]. Departamento de Biologia, Universidade Estadual de Feira de Santana, Feira de Santana - BA. Apesar do número crescente de cepas bacterianas resistentes a antibióticos, o investimento das indústrias farmacêuticas no desenvolvimento de novos antibacterianos tem sido cada vez menor. Uma alternativa para contornar esse dilema é modular fatores de virulência bacterianos. Embora piocianina seja um fator de virulência usado como marcador no desenvolvimento de fármacos que modulem a virulência de Pseudomonas aeruginosa, enzimas responsáveis pela sua biossíntese nunca foram exploradas como potenciais alvos terapêuticos. A fim identificar quais das 9 enzimas envolvidas na biossíntese de piocianina são moduláveis por micromoléculas, ferramentas in silico foram utilizadas. De acordo com os servidores Ftmap e PockDrug, as enzimas PhzA, PhzB, PhzD e PhzS podem ligar-se a compostos similares à farmacos com afinidade nanomolar, enquanto PhzM deve ter ligantes de ordem micromolar. Considerando que PhzS cataliza a última etapa de biossíntese de piocianina usando NADH como cofator, a estratégia de bioisosterismo foi empregada para selecionar derivados de tiazolidin-2,4-diona que mimetizam o perfil de interações do anel purina no seu sítio de ligação em PhzS. Essa estratégia levou a identificação do composto 1 (5-(4-((4-oxo-3-fenil-3,4-dihidroquinazolin-2-il)metoxi)benzilideno)tiazolidino-2,4-diona) que apresenta afinidade micromolar por PhzS (Kd 18 M) e mecanismo de inibição competitivo com o cofator na sua forma oxidada. A seguir, a estratégia de simplificação molecular foi empregada para aumentar a a eficiecia de ligação (LE) dessa classe de compostos. Essa estratégia levou ao desenvolvimento do composto 13 (5-(2,4-dimetoxifenil)tiazolidino-2,4-diona) com Kd = 1,68 M e LE=0,45, mais do que o dobro daquela encontrada para o compostos 1 (LE = 0,20). A fim de alcançar resultados semelhantes com a enzima PhzM foram envidados esforços para obter a estrutura cristalográfica dessa enzima em complexo com SAM (cofator). A estrutura cristalográfica do complexo (2,2 Å) revela, de forma inédita, os resíduos que fazem parte do sítio do cofator. Adicionalmente, essa estrutura sugere que o resíduo TYR133 poderia participar do mecanismo catalítico de PhzM. Ensaios de deslocamento térmico mostram que Y133F-PhzM não apresenta modificações significativas na sua capaicdade de interagir com o suubstrato ou seu cofator. Todavia a atividade catalítica do mutante é abolida. A estrutura cristalográfica do mutante Y133F-PhzM (1.82Å) revela que as interações do cofator não se alteram e que a hélice onde a Tyr133 se encontra, tem elevado índice de frustação proteíca. Os resultados acima resultaram numa proposta de um novo mecanismo catítico para a PhzM. Os resultados descritos acima fazem uso, majoritariamente, de abordagens focadas no alvo, enquanto a taxa de sucesso do desenvolvimento de fármacos a partir de abordagens fenotípicas tem se mostrado superior. A fim de cobrir essa lacuna do projeto, ensaios celulares foram realizados para avaliar moléculas de origem natural ou sintética. Essa abordagem resultou na identificação de derivados cumarínicos (ex. 10k) que reduzem a produção da piocianina (EC50 7 ± 2 μM), a motilidade e a formação de biofilme de P. aeruginosa, o que sugere um mecanismo de ação em nível de quorum sensing. O mecanismo de ação da calicopterina, oriunda do extrato etanólico da Marcetia latifolia, parece envolver os níves de di-GMPc, pois esse composto reduz a produção de piocianina (EC50= 32µM) e a motilidade, porém ele aumenta a formação do biofilme em P. aeruginosa.