Os padrões de qualidade para o biodiesel comercializado no Brasil são estabelecidos pela Agência Nacional de Petróleo, Gás Natural e Biocombustíveis (ANP), por meio da Resolução Brasileira nº 45 de 2014 (RANP 45/2014). A RANP 45/2014 estipula o teor máximo de 0,02% m/m de glicerol livre no biodiesel adicionado ao diesel. Maiores concentrações de glicerol podem levar a problemas nos tanques de armazenamento do combustível, formação de depósitos e entupimento no sistema de injeção do motor, além de emissão de aldeídos tóxicos. Neste trabalho, uma nova abordagem para a determinação de glicerol livre em biodieseis provenientes de óleos de soja, palmiste, macaúba (polpa) e fritura foi desenvolvida empregando a oxidação do glicerol com periodato e mascaramento do periodato excedente com molibdato. Isto diminuiu o tempo requerido para a oxidação, pelo excesso de periodato empregado. O iodato formado na oxidação do glicerol foi quantificado a partir do ânion tri-iodeto produzido após adição de iodeto. A determinação iodométrica foi realizada empregando as técnicas espectrofotométrica e titrimétrica, em três dias de análise. O método espectrofotométrico foi baseado na extração do glicerol por partição em etanol-água/n-heptano, e determinação do tri-iodeto na presença de amido, em λ = 582 nm. Duas curvas analíticas foram construídas a partir da leitura de padrões de glicerol em espectrofotômetro de feixe duplo e único. Este último gerou medidas de maior precisão e curva analítica com baixos limites de detecção (1,9 mg L-1) e quantificação (5,7 mg L-1), e coeficiente de determinação (R2) de 0,9972. Na análise dos biodieseis, a repetibilidade do método foi satisfatória (CV < 12%), ao contrário da precisão intermediária (CV < 39%), segundo a ANOVA dos teores de glicerol livre obtidos entre os dias. O método titrimétrico foi aplicado na análise de padrões aquosos de glicerol, a partir da titulação do tri-iodeto com solução padrão de Na2S2O3, na presença de amido, e apresentou excelente exatidão, com erros relativos inferiores a ± 3,0%. Limites de detecção e quantificação de 1,2 mg L-1 e 3,5 mg L-1, respectivamente, foram encontrados a partir de uma curva de resposta. Para a análise titrimétrica dos biodieseis, foi realizada anteriormente, a extração do glicerol livre por partição em água/n-heptano. A precisão deste método foi boa em nível de repetibilidade (CV < 14%) e em termos de precisão intermediária (CV < 8%), avaliada pela ANOVA. A exatidão do método titrimétrico foi avaliada frente a testes de recuperação em 3 níveis de fortificação: 250, 500 e 1000 mg L-1 e alcançou entre 91% e 105% de recuperação. Os teores médios globais de glicerol livre nos biodieseis obtidos pelos dois métodos não diferiram significativamente ao nível de confiança de 95%, segundo teste t de Student. No entanto, o método titrimétrico apresentou menores variações entre os dias, menor custo e maior simplicidade em comparação ao método espectrofotométrico. Além disso, permite quantificar o glicerol no biodiesel em um curto tempo (cerca de 10 minutos), quando comparado às demais técnicas de análise descritas na literatura, e apresenta um menor limite de detecção, em comparação a outros métodos titrimétricos.