Esta pesquisa teve como objetivo, diagnosticar Leptospira spp. em animais silvestres, humanos e seus animais domésticos e identificar os sorovares mais frequentes e verificar se há correlação entre os achados em humanos e nos animais domésticos. Para isso, foram selecionadas duas comunidades rurais nos municípios de Santa Bárbara e Peixe-boi, ambos no estado do Pará, localizadas próximo a áreas de remanescentes florestais. Nestas localidades foram coletadas um total de 695 amostras biológicas. Sendo 233 amostras em Santa Bárbara (118 cães, 10 gatos, 80 humanos, 14 roedores e 11 marsupiais) e em Peixe-Boi, 462 amostras (168 cães, 16 gatos, 221 humanos, 13 suínos, um caprino, oito bubalinos, nove bovinos, nove equinos, três ovinos, 16 marsupiais e sete roedores silvestres). A colheita de sangue dos humanos e seus animais domésticos respectivamente, foi realizada por punção venosa em tubos sem e com anticoagulante para obtenção de soro e sangue total. A captura dos animais silvestres foi realizada utilizando armadilhas de contenção do tipo Sherman, Pitfall e Tomahawk instaladas no interior, borda e zona urbano-rural adjacente aos remanescentes florestais. Os animais silvestres capturados foram eutanasiados para coleta de fragmentos de tecido de fígado, rim e baço. Com as amostras de soro, foram realizados o Teste de Aglutinação Microscópica utilizando 19 sorogrupos de leptospiras para detecção de anticorpos anti-Leptospira spp., já as amostras de sangue total e fragmentos de tecidos dos animais silvestres foram submetidas a extração de DNA para a realização da PCR com o intuito de detectar o DNA de Leptospira spp., utilizando os genes 16S rRNA e “LipL32”. Detectou-se DNA do agente em 12% (3/25) dos fragmentos renais de duas espécies de marsupiais (Didelphis marsupialis e Marmosops pinheiroi) e em fragmento de fígado de uma espécie de roedor (Echimys chrysurus) no município de Santa Bárbara. Observou-se também que o DNA de Leptospira spp. foi detectado apenas em amostras de 13 cães, que demonstraram 100% de identidade com o DNA de L. interrogans depositado no GenBank. Em relação a MAT, 24,03% (50/208) de amostras de soro de humanos e cães de Santa Bárbara foram reativo, onde os sorogrupos circulantes mais prevalentes na população humana e animal foram Canicola, Djasiman, Cynopteri e Sejroe. No município de Peixe-Boi o DNA de Leptospira foi detectado em 3,42% (16/467) das amostras, referindo-se a 2,97% (05/168) dos cães, 6,25% (1/16) felinos, 33,33% (3/9) equinos, 25% (2/8) bubalinos e 2,26% (05/221) em humanos, sendo observado que nenhuma das amostras de sangue dos bovinos, suínos, caprinos e ovinos, assim como fragmentos de tecidos de pequenos mamíferos silvestres foram positivas. No MAT 12,61% (56/444) das amostras de cães, gatos, equinos, suínos e humanos foram reagentes para os sorogrupos Canicola, Celledoni, Sejroe e Icterohaemorrhagiae. Nenhum dos ruminantes como caprinos, ovinos, bubalinos e bovinos apresentaram presente de anticorpos contra bactéria. Conclui-se que há presença de Leptospira spp. nas amostras oriundas das comunidades rurais estudadas, observando-se a infecção natural pelo agente em humanos, animais domésticos e silvestres provenientes de áreas de remanescentes florestais da Amazônia oriental.