A leptospirose é uma zoonose de impacto global e de importância em saúde única causada por espécies patogênicas do gênero Leptospira. Essas bactérias podem interagir de forma distinta com os hospedeiros e com o ambiente. Em humanos e animais domésticos pode ocorrer infecção de forma direta ou indireta, por contato com ambiente contaminado com leptospiras eliminadas na urina de portadores renais. Após penetrar um hospedeiro suscetível, os desfechos clínicos podem variar entre infeções sem comprometimento clínico a quadros fulminantes que evoluem a óbito e que podem apresentar duas fases denominadas de leptospiremia (multiplicação pelos humores orgânicos) e leptospiúria (eliminação pela urina). Dada a quantidade de espécies já identificadas e uma sorovariedade complexa, reservatórios não mamíferos, como os quelônios, têm sido usados como modelos de investigação na cadeia epidemiológica da leptospirose, em síntese, por serem organismos semiaquáticos que transitam no solo e na água. Com isso, o objetivo deste trabalho foi investigar a presença de Leptospira spp. em amostras de Muçuãs (Kinosternon scorpioides) de cativeiro, na Amazônia Brasileira. O local do estudo foi na área destinada ao Projeto Bio-Fauna do Instituto Socioambiental e dos Recursos Hídricos (ISARH), campus sede da Universidade Federal Rural da Amazônia – UFRA em Belém do Pará. Foram 40 animais selecionados e 147 amostras obtidas, sendo 40 de lavado estomacal, 40 de lavado cloacal, 40 amostras de sangue e 27 de urina. Após processamento, as amostras foram submetidas a extração com o Kit IllustraTM Tissue and Cell Prep Mini Spin (GE Healthcare®), seguida de uma PCR convencional para amplificar um fragmento de 331 pb do gene 16S rRNA de Leptospira, assim, os produtos foram submetidos a eletroforese em gel de agarose a 1,5% e corados com GelRed® para visualização em um transiluminador com sistema de fotodocumentação. As melhores amplificações foram enviadas para sequenciamento em uma instalação comercial. As sequências obtidas foram submetidas a pesquisa BLASTn utilizando o servidor do Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia,selecionado as de maior pontuação e a análise filogenética foi conduzida pelo método de Neighbor-Joining. Dentre os quelônios testados, 40% (16/40) apresentaram pelo menos uma amostra positiva para Leptospira spp., considerando a quantidade de amostras coletadas, 12,24% (18/147) positivaram, assim, onze amostras foram sequenciadas e apresentaram de 99% a 100% de identidade com sequências de Leptospira interrogans, resultado confirmado pela análise filogenética. Esta é a primeira detecção molecular de Leptospira spp. em Kinosternon scorpioides no mundo e também de DNA leptospiral na urina (micção espontânea), coágulo sanguíneo,lavado cloacal e estomacal em quelônios na Amazônia Brasileira e, com o maior quantitativo de quelônios positivos no Brasil utilizando tal método. Com o exposto,infere-se que, os Muçuãs testados foram expostos a Leptospira patogênica e capazes de albergar DNA das bactérias em seus fluidos corporais, sinalizando seus potenciais papeis como reservatórios.