O leite bubalino é um alimento que se destaca por sua grande riqueza nutricional. Um dos seus principais derivados é o queijo, que possui grande aceitação por parte dos consumidores. Devido à baixa disponibilidade e a sazonalidade da produção desta matéria prima, fraudes em seus derivados são comumente relatadas, principalmente devido a adição indiscriminada de leite bovino ao produto. Outro fator relevante ao que se refere a este alimento é a proliferação de diversos microrganismos patogênicos, como Listeria monocytogenes e Salmonella spp. O Arquipélago do Marajó, localizado do no Pará, é um polo de criação de búfalos, onde são produzidos e comercializados derivados do leite desta espécie, tais como o Queijo do Marajó. Este produto tem caráter artesanal e é regulado pela portaria Nº0418/2013 da Agência de Defesa Agropecuária do Estado do Pará, que determina que a inclusão de leite bovino pode ocorrer durante a produção, desde que não ultrapasse 40% da matéria prima e que a incorporação seja informada no rótulo. Entre os métodos de detecção de fraudes e de agentes microbianos, a Reação em Cadeia da Polimerase multiplex é considerada uma importante ferramenta para a detecção simultânea de várias sequências de DNA. Sendo assim, o grupo de pesquisa em Higiene e Qualidade de Alimentos do Instituto De Medicina Veterinária da UFPA propôs uma PCR quadriplex para a detecção simultânea da presença de DNA bovino, bubalino, de Salmonella spp. e de Listeria monocytogenes em queijos de búfala e, embora a técnica proposta tenha se mostrado eficiente em nível laboratorial, sua eficiência em nível de campo ainda necessitava ser testada. Com base nisso, o objetivo do presente trabalho foi aplicar a PCR quadriplex previamente proposta em queijos bubalinos comercializados na Ilha do Marajó-PA, a fim de validar a técnica para utilização por serviços de fiscalização. Os resultados obtidos apontaram que a técnica foi capaz de identificar o DNA das espécies analisadas em queijos comerciais e que a fraude por incorporação de leite bubalino e a contaminação por Salmonella spp. estão presentes na região alvo do estudo. Concluímos que a técnica apresentada é capaz de apontar fraudes e contaminação por Listeria monocytogenes e Salmonella spp. em queijos de búfala comercialmente disponíveis e que esta pode ser uma importante ferramenta a ser utilizada por órgãos fiscalizadores.